Sequenziamento del trascrittoma di singole cellule dei neuroni inspiratori del complesso preBötzinger nei topi neonati
Dati scientifici volume 9, numero articolo: 457 (2022) Citare questo articolo
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I neuroni nel complesso preBötzinger del tronco encefalico (preBötC) generano il ritmo e lo schema motorio rudimentale per i movimenti respiratori inspiratori. Abbiamo eseguito registrazioni di patch-clamp di cellule intere da neuroni inspiratori nel preBötC di fettine di topo neonatale che mantengono la ritmicità correlata alla respirazione in vitro. Abbiamo classificato i neuroni in base alle loro proprietà elettrofisiologiche e al background genetico, quindi abbiamo aspirato il loro contenuto cellulare per il sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq). Questo set di dati fornisce le sequenze nucleotidiche grezze (file FASTQ) e i file annotati delle sequenze nucleotidiche mappate sul genoma del topo (mm10 da Ensembl), che include il conteggio dei frammenti, la lunghezza dei geni e i frammenti per kilobase di trascrizione per milione di letture mappate (FPKM ). Questi dati riflettono i trascrittomi dei neuroni che generano il ritmo e lo schema dei movimenti respiratori inspiratori.
Misurazione(i)
sequenze nucleotidiche
Tipi di tecnologia
Sequenziamento Illumina
Tipi di fattori
genotipo: neuroni derivati da Dbx1 vs. neuroni non derivati da Dbx1 nel complesso preBötzinger del topo • proprietà elettrofisiologiche: neuroni del complesso inspiratorio preBötzinger di tipo 1 vs. tipo 2
Caratteristica del campione: organismo
Muscolo del topo
Caratteristica del campione - Ambiente
ambiente di laboratorio
Caratteristica del campione: posizione
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L'inesorabile fase attiva della respirazione è l'inspirazione, in cui la discesa del diaframma e l'innalzamento delle costole dilata i polmoni per inspirare aria1. Il ritmo dell'ispirazione emana dal sito inferiore del tronco cerebrale chiamato complesso preBötzinger (preBötC)2,3,4. Gli elementi ritmici principali del preBötC sono interneuroni derivati da cellule precursori che esprimono il gene homeobox che sviluppa l'homeobox cerebrale-1 (Dbx1), di seguito denominati neuroni Dbx15,6,7,8,9,10. I neuroni Dbx1 trasmettono anche il ritmo inspiratorio come modello di uscita ai premotoneuroni e ai motoneuroni per i muscoli della pompa e delle vie aeree11,12. L'ispirazione inizia con una fase preinspiratoria attribuita esclusivamente ai neuroni ritmogeni11,13,14. Quando la loro attività raggiunge una soglia, si verifica un'esplosione inspiratoria che recluta neuroni che influenzano e trasmettono il modello per l'output motorio13,14,15. I neuroni che generano ritmo e pattern sono i due sottoinsiemi della popolazione di neuroni Dbx1 nel preBötC.
I generatori di ritmo e di pattern possono essere differenziati elettrofisiologicamente. I neuroni di tipo 1 sono presumibilmente ritmogeni. Si attivano con una somma simile a una rampa di potenziali sinaptici 300-500 ms prima dell'inizio di un burst inspiratorio di grande ampiezza16,17. I neuroni di tipo 1 esprimono la corrente K+ transitoria di tipo A (IA). Il blocco dell'IA destabilizza il ritmo inspiratorio e l'attività preinspiratoria complessiva in vitro18. I neuroni di tipo 2 sono presumibilmente specializzati per generare il modello di output. Si attivano ~ 300 ms più tardi del Tipo-116,17 ed esprimono corrente cationica mista attivata dall'iperpolarizzazione (Ih), la cui manipolazione influenza l'output motorio19.
Abbiamo differenziato elettrofisiologicamente i neuroni di tipo 1 e di tipo 2 durante le registrazioni di patch-clamp di cellule intere. Nonostante la disparità ben caratterizzata tra i tipi, alcuni neuroni mostrano una fisiologia ambigua e non possono essere classificati in modo affidabile; li chiamiamo Sconosciuti ma li consideriamo comunque importanti per la respirazione perché sono nel preBötC e sono ritmicamente attivi in fase con l'inspirazione in vitro. Abbiamo recuperato il contenuto citoplasmatico ed eseguito il sequenziamento dell'RNA di nuova generazione su 10 campioni: quattro neuroni di tipo 1 (tre da precursori che esprimono Dbx1 e uno ottenuto da un topo CD-1 wild-type senza reporter Dbx1), un neurone di tipo 2 da un precursore che esprime Dbx1, così come 5 neuroni sconosciuti da topi wild-type CD-1. Tutti i neuroni sono stati registrati e l'RNA estratto entro due mesi e inviato insieme per il sequenziamento di prossima generazione.