Caratterizzazione di resistomi antibiotici mediante batteriofago riprogrammato

Nature Microbiology volume 8, pagine 410–423 (2023) Citare questo articolo

10mila accessi

79 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

La metagenomica funzionale è un potente strumento sperimentale per identificare i geni di resistenza agli antibiotici (ARG) nell'ambiente, ma la gamma di specie batteriche ospiti adatte è limitata. Questa limitazione influenza sia la portata degli ARG identificati sia l’interpretazione della loro rilevanza clinica. Qui presentiamo una pipeline di metagenomica funzionale chiamata Metagenomica funzionale multispecie assistita da particelle di batteriofago riprogrammato (DEEPMINE). Questo approccio combina e migliora l'uso del batteriofago T7 con fibre di coda scambiate e mutagenesi mirata per espandere la specificità dell'ospite del fago e l'efficienza per la metagenomica funzionale. Queste particelle fagiche modificate sono state utilizzate per introdurre grandi librerie di plasmidi metagenomici in patogeni batterici clinicamente rilevanti. Eseguendo lo screening degli ARG nei microbiomi del suolo e dell’intestino e nei genomi clinici rispetto a 13 antibiotici, dimostriamo che questo approccio amplia sostanzialmente l’elenco degli ARG identificati. Molti ARG hanno effetti specie-specifici sulla resistenza; forniscono un elevato livello di resistenza in una specie batterica ma producono una resistenza molto limitata in una specie correlata. Infine, abbiamo identificato gli ARG mobili contro gli antibiotici attualmente in fase di sviluppo clinico o recentemente approvati. Nel complesso, DEEPMINE espande gli strumenti di metagenomica funzionale per lo studio delle comunità microbiche.

La metagenomica consente l'analisi esaustiva delle comunità microbiche, comprese le specie che non possono essere coltivate in condizioni di laboratorio. Estraendo dati genomici da campioni ambientali, i ricercatori acquisiscono conoscenze sulla composizione delle specie e sulla funzionalità del microbioma in una serie di ambienti naturali1. In particolare, la metagenomica funzionale è dedicata allo screening del DNA metagenomico per la presenza di geni che codificano specifiche funzioni molecolari2,3,4. La clonazione e l'espressione del DNA metagenomico frammentato in un ospite batterico possono rivelare proteine ​​precedentemente non descritte. Le applicazioni della metagenomica funzionale includono l'identificazione di enzimi, l'esplorazione di agenti bioattivi e lo screening dei geni di resistenza agli antibiotici che risiedono nell'ambiente5,6,7,8. Le librerie contengono tipicamente milioni di frammenti di DNA, corrispondenti a una copertura totale di 5–100 Gb, la dimensione di migliaia di genomi batterici7,9,10.

Sebbene la metagenomica funzionale possa essere potenzialmente utile per diverse aree di ricerca, nella sua forma attuale la metodologia è lungi dall’essere perfetta, il che ne limita l’applicabilità. Date le enormi dimensioni delle librerie plasmidiche, l'efficace introduzione di queste librerie in un ospite batterico è di fondamentale importanza. Tuttavia, questo processo, tipicamente mediante elettroporazione, coniugazione o trasduzione convenzionale di batteriofagi, è complicato ed è efficace solo per una gamma limitata di ceppi di laboratorio11,12. Questa limitazione ha conseguenze di vasta portata sull'applicabilità degli schermi metagenomici funzionali e sulla generalità delle conclusioni che possono essere tratte13,14. Ad esempio, ostacola lo screening di geni biotecnologicamente o clinicamente rilevanti che sono funzionali solo in specifiche specie batteriche 12,15,16. In particolare, la maggior parte degli screening metagenomici per i geni di resistenza agli antibiotici (ARG) si basano fortemente sull'uso di ceppi di laboratorio di Escherichia coli come ospiti batterici5,17,18. Pertanto, gli ARG che non forniscono resistenza in questi ceppi ma lo fanno in altri patogeni clinicamente rilevanti rimangono non rilevabili. Infatti, studi precedenti indicano che l'impatto delle mutazioni di resistenza agli antibiotici sui fenotipi di resistenza dipende dal background genetico dell'ospite batterico19. Inoltre, gli screening metagenomici in più batteri ospiti potrebbero fornire preziose informazioni sulla compatibilità funzionale interspecie e sulla mobilità degli ARG20.

In questo articolo, presentiamo la metagenomica funzionale multi-specie assistita da particelle di batteriofago riprogrammato (DEEPMINE), che fornisce una soluzione a questi problemi (Fig. 1a). DEEPMINE si basa su un lavoro precedente che mirava ad estendere la gamma ospite di particelle fagiche T7 per la trasduzione del DNA scambiando le code tra diversi tipi di batteriofagi21. DEEPMINE impiega tali particelle trasduttrici di batteriofago modificato per fornire grandi librerie di plasmidi metagenomici in una gamma di specie batteriche. Inoltre, abbiamo applicato l'evoluzione diretta del laboratorio per aumentare l'efficienza di tale distribuzione delle librerie22. Utilizzando questo approccio, abbiamo eseguito screening metagenomici in patogeni batterici clinicamente rilevanti della famiglia delle Enterobacteriaceae. Abbiamo identificato diversi ARG precedentemente non segnalati con effetti specie-specifici sulla sensibilità agli antibiotici. Inoltre, abbiamo studiato una serie di antibiotici che sono stati approvati solo di recente per uso clinico o che sono in fase avanzata di sviluppo clinico e abbiamo dimostrato che questi nuovi antibiotici sono altrettanto inclini alla formazione di resistenza quanto i vecchi antibiotici dopo decenni di uso clinico (Extended Data Tabella 1).