Sequenziamento del trascrittoma di singole cellule dei neuroni inspiratori del complesso preBötzinger nei topi neonati

Dati scientifici volume 9, numero articolo: 457 (2022) Citare questo articolo

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I neuroni nel complesso preBötzinger del tronco encefalico (preBötC) generano il ritmo e lo schema motorio rudimentale per i movimenti respiratori inspiratori. Abbiamo eseguito registrazioni di patch-clamp di cellule intere da neuroni inspiratori nel preBötC di fettine di topo neonatale che mantengono la ritmicità correlata alla respirazione in vitro. Abbiamo classificato i neuroni in base alle loro proprietà elettrofisiologiche e al background genetico, quindi abbiamo aspirato il loro contenuto cellulare per il sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq). Questo set di dati fornisce le sequenze nucleotidiche grezze (file FASTQ) e i file annotati delle sequenze nucleotidiche mappate sul genoma del topo (mm10 da Ensembl), che include il conteggio dei frammenti, la lunghezza dei geni e i frammenti per kilobase di trascrizione per milione di letture mappate (FPKM ). Questi dati riflettono i trascrittomi dei neuroni che generano il ritmo e lo schema dei movimenti respiratori inspiratori.

Misurazione(i)

sequenze nucleotidiche

Tipi di tecnologia

Sequenziamento Illumina

Tipi di fattori

genotipo: neuroni derivati ​​da Dbx1 vs. neuroni non derivati ​​da Dbx1 nel complesso preBötzinger del topo • proprietà elettrofisiologiche: neuroni del complesso inspiratorio preBötzinger di tipo 1 vs. tipo 2

Caratteristica del campione: organismo

Muscolo del topo

Caratteristica del campione - Ambiente

ambiente di laboratorio

Caratteristica del campione: posizione

contigui Stati Uniti d'America

L'inesorabile fase attiva della respirazione è l'inspirazione, in cui la discesa del diaframma e l'innalzamento delle costole dilata i polmoni per inspirare aria1. Il ritmo dell'ispirazione emana dal sito inferiore del tronco cerebrale chiamato complesso preBötzinger (preBötC)2,3,4. Gli elementi ritmici principali del preBötC sono interneuroni derivati ​​da cellule precursori che esprimono il gene homeobox che sviluppa l'homeobox cerebrale-1 (Dbx1), di seguito denominati neuroni Dbx15,6,7,8,9,10. I neuroni Dbx1 trasmettono anche il ritmo inspiratorio come modello di uscita ai premotoneuroni e ai motoneuroni per i muscoli della pompa e delle vie aeree11,12. L'ispirazione inizia con una fase preinspiratoria attribuita esclusivamente ai neuroni ritmogeni11,13,14. Quando la loro attività raggiunge una soglia, si verifica un'esplosione inspiratoria che recluta neuroni che influenzano e trasmettono il modello per l'output motorio13,14,15. I neuroni che generano ritmo e pattern sono i due sottoinsiemi della popolazione di neuroni Dbx1 nel preBötC.

I generatori di ritmo e di pattern possono essere differenziati elettrofisiologicamente. I neuroni di tipo 1 sono presumibilmente ritmogeni. Si attivano con una somma simile a una rampa di potenziali sinaptici 300-500 ms prima dell'inizio di un burst inspiratorio di grande ampiezza16,17. I neuroni di tipo 1 esprimono la corrente K+ transitoria di tipo A (IA). Il blocco dell'IA destabilizza il ritmo inspiratorio e l'attività preinspiratoria complessiva in vitro18. I neuroni di tipo 2 sono presumibilmente specializzati per generare il modello di output. Si attivano ~ 300 ms più tardi del Tipo-116,17 ed esprimono corrente cationica mista attivata dall'iperpolarizzazione (Ih), la cui manipolazione influenza l'output motorio19.

Abbiamo differenziato elettrofisiologicamente i neuroni di tipo 1 e di tipo 2 durante le registrazioni di patch-clamp di cellule intere. Nonostante la disparità ben caratterizzata tra i tipi, alcuni neuroni mostrano una fisiologia ambigua e non possono essere classificati in modo affidabile; li chiamiamo Sconosciuti ma li consideriamo comunque importanti per la respirazione perché sono nel preBötC e sono ritmicamente attivi in ​​fase con l'inspirazione in vitro. Abbiamo recuperato il contenuto citoplasmatico ed eseguito il sequenziamento dell'RNA di nuova generazione su 10 campioni: quattro neuroni di tipo 1 (tre da precursori che esprimono Dbx1 e uno ottenuto da un topo CD-1 wild-type senza reporter Dbx1), un neurone di tipo 2 da un precursore che esprime Dbx1, così come 5 neuroni sconosciuti da topi wild-type CD-1. Tutti i neuroni sono stati registrati e l'RNA estratto entro due mesi e inviato insieme per il sequenziamento di prossima generazione.